综述｜Reviews in Aquaculture：水产养殖中微生物宏基因组技术的应用前景
论文信息
论文题目：Microbial metagenomics in aquaculture: a potential tool for a deeper insight into the activity
期刊：Reviews in Aquaculture
IF：7.19
发表时间：2017
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近几十年来，针对水产养殖环境微生物的应用和研究已经成为了一个热门的方向。宏基因组技术作为一个相对较新的基因组学分支，是分析微生物群落所包含的复杂基因组的有效工具，然而，其在水产养殖领域的应用还并不常见。
在本综述中，介绍了水产养殖中宏基因组技术的可能应用方向，包括微生物多样性、微环境中微生物的作用、抗生素抗性基因、新型和潜在的致病菌、微生物群落形成的生物絮团、益生菌等等。
引言
水产养殖对于人类社会所产生的有利和不利后果在过去的几十年间已经被广为研究，通过不同学科间的关联研究，水产养殖所带来的大部分有益效应已经被阐明，这些结果促进了更加有效的养殖操作和技术的发展，包括密集型养殖、最适饵料配比、新型养殖物种、循环养殖系统、混合养殖系统、生物膜技术等等。
特别要指出的是，近些年，应用水产养殖中的微生物作为环境生物指示者、生物修复排外废物、益生菌或者直接作为养殖物种的食物等方面得到了大力的发展。尽管如此，大多数在养殖系统中广泛存在的细菌所发挥的功能还并不清楚。在养殖环境中超过99%的细菌均不能很容易的或的纯培养，因此，作为最基础研究的养殖环境微生物多样性都并未完全研究清楚。
研究人员为了或的养殖环境微生物多样性和动力学的详细信息做了很多的工作，但是传统的方法，例如改进培养基、微生物筛选和培养技术、形态学技术等，都不能有效的或的不可培养微生物的相关信息。此外，大多数微生物学书籍中的信息均是基于纯培养微生物的实验结果，很多时候这些实验的条件与自然环境中并不一致。
宏基因组技术是近年来发展出的一种有前景的研究工具，其尝试去分析复杂环境微生物群落中的基因组信息，该技术并不需要或的微生物的纯培养，只需要根据微生物群落的DNA就可以得到特定环境中微生物多样性、功能和生物学作用的相关信息。
宏基因组技术的发展使得微生物的研究从“谁在那？”发展到“它们在干什么？”。
宏基因组技术可以分为两个不同的研究方向：环境中单一基因的研究以及随机鸟枪法评估环境中的所有基因。
基于单一基因的宏基因组技术关注特定的基因，应用PCR技术对特定基因进行扩增，之后进行测序和分析。而随机鸟枪法研究理论上能够获得环境样品中的所有基因，但是实际中得到的基因并不能达到100%，因为还并没有技术能够一次性的得到数千种不同细菌的完整基因组。因此，无论哪种研究，均是对环境样品中基因的片段进行测序。
第二代测序技术目前已经取代了Sanger测序称为了研究小规模基因组和环境基因组的主流工具，其可以同时得到数百万条序列的信息，但是如果想要得到100%基因的覆盖，还是只能依赖于第三代测序技术。
目前，宏基因组技术主要应用于医学和生态学领域，而在水产养殖中使用的频率还比较低，主要是由于宏基因组技术成本较高。但是，近5年来，宏基因组技术的成本持续下降，目前单独的实验室已经能够承担宏基因组所需的费用。
宏基因组技术在水产养殖中的潜在应用
水产养殖环境可以被看作是微生物的一种人工培养介质，在海洋微生物基因组数据库中包含了大约4000亿的DNA碱基对，在1mL的海水中只能包含其中的3%，而在水产养殖环境中，含N和P的代谢物及有机制十分丰度，使得水产养殖环境成为微生物繁殖的理想介质，因此，水产养殖环境中微生物的丰度程度要明显更高。
目前，对于水产养殖微生物信息的了解只能代表完整微生物群落的一小部分，如果不使用其它的新技术，想要获得养殖环境不可培养微生物的完整多样性和潜在功能是十分困难的，而这一问题可以被宏基因组和功能基因组技术回答。
水样养殖环境微生物的研究中最重要的方向就是获得微生物与养殖物种之间的共生或拮抗关系，而宏基因组可以获得与特定宿主或生态系统相关的微生物信息，从而深入的探讨微生物与养殖物种的关系。例如针对很难被分离培养的细胞内致病菌，宏基因组测序结合生物信息学分析不进能够得到细胞内细菌的多样性还能够分析细菌与宿主之间的相互作用。
随着宏基因组测序成本的降低，其已经不仅仅是一个定性工具，还能够进行定量的分析，宏基因组允许研究人员得到一个空间或时间尺度内特定微生物或基因的多样性及丰度，从而能够探索微生物群落与宿主特定基因型或表型的关联。
微生物多样性
基于纯培养技术的微生物研究并不足以获得微生物群落的完整多样性，现在，可以应用基于16S 或18S rDNA可变区的扩增子测序技术获得环境微生物群落的完整多样性信息。
基于针对16S和18S rDNA保守区设计的特异性引物，可以从环境DNA样品中扩增得到能够用于进行分类学鉴定的基因片段。
微环境中微生物的作用
基因是所有生物基因组中最基础的功能单元，由于水产养殖环境微生物群落多样性和动力学的信息还十分不完善，因此，应用随机鸟枪法对水产养殖环境的所有基因进行测序，从而获得养殖微生物功能基因的信息具有很高的应用前景。
对养殖环境进行宏基因组测序，可以更好的理解致病菌爆发的原因、益生菌的功能、细菌中抗生素抗性的富集、细菌在食物链中的作用等等。
确定养殖系统中由微生物介导的代谢过程，能够使得养殖人员更高的调控微生物群落，从而达到增强营养物质的生物化学循环、改善微生物群落、干扰导致疾病爆发的关键过程等目的。
由微生物中特定基因介导的代谢过程具有重要的研究价值，而在水产养殖环境中，一些基因的重要性更加凸显。水产养殖每年会产生数百万吨的废物，其中主要为含N、P和C的物质，这些废物有些具有毒性，同时会增加生态系统的营养负荷，因此研究研究与水产养殖中常见废物识别、摄入和利用相关的微生物及其功能基因变得极端重要，因为这些信息能够绘制出微生物群落进行营养物质循环的生物化学路径，同时评估其代谢养殖废物的能力，此外，这些功能微生物及其基因还能够被用于养殖废物的生物修复和再利用。
抗生素抗性基因
抗生素的滥用也是水产养殖环境中的一个常见现象，其会导致致病菌对抗生素抗性的增强，但是养殖环境中抗生素抗性基因的分布、多样性和来源还并不清楚，特别是在不可培养微生物中。
目前针对水产养殖环境中抗生素抗性的研究大多只关注致病菌，而对普通细菌中的抗生素抗性单元的了解很少，这些普通细菌中的抗生素抗性单元可以通过转座子、质粒、噬菌体介导的水平基因转移在不同细菌间快速传播，从而使得致病微生物获得抗生素抗性。
传统的检测抗生素抗性的方法是测定特定细菌对于抗生素的最小抑制浓度，这种方法首先要得到纯培养的细菌，因而无法分析微生物群落的抗生素抗性。随后，基于定量PCR和微列阵技术研究抗生素抗性的方法被开发出来，但是这些技术只能测定少数特定的抗生素抗性基因，而无法对一个环境微生物群落的抗生素抗性进行光谱型的扫描。
宏基因组技术的发展使得评估微生物群落中抗生素抗性组的结构成为可能，目前应用宏基因组研究抗生素抗性的方法根据其目的不同分为两类：基于功能筛选的宏基因组和基于测序比对的宏基因组。
基于功能筛选的宏基因组首先要建立克隆文库，之后应用抗生素进行筛选，之后进行测序，得到的结果全部是能够抵抗所用抗生素的功能基因。
基于序列比对的宏基因组是直接对样品的DNA进行测序，之后通过与抗生素抗性基因数据库比对，注释其中所含有的抗生素抗性基因并计算其丰度。
致病菌检测
高丰度和多样性的病毒是水产养殖中另一个常见的问题，与细菌的研究类似，目前常用的病毒诊断方法并不能有效的识别新型病毒，目前已经有了专门设计针对与病毒研究的宏基因组技术方法。
在水产养殖系统中，对于致病菌或病毒的鉴定通常是在一种重要的疾病爆发之后才开始的，而宏基因组技术使得在一种新型致病菌或病毒造成爆发性疾病之前就可以被发现。
微生物群落形成生物絮团
常规的水产养殖活动大多使用人工投喂饵料，有70%-80%的饵料会残留在水体和沉积物中，不仅造成经济的浪费，还会产生许多的有毒残留物质。
应用生物膜或生物絮团作为水产养殖动物的食物在过去的几十年间不断的取得成功，生物絮团的应用使得养殖人员可以提高水产养殖的密集程度，从而提高养殖活动的产量和效益。
生物絮团通常是由多种不可培养微生物组成，因此应用宏基因组研究其多样性是十分必要的，同时，生物絮团的形成需要吸收大量的N和C，这些微生物中必然含有N和C代谢所需的基因，但是微生物利用C和N形成生物絮团的内在机制还并不清楚。
有研究表明，生物絮团具有预防疾病爆发的功能，应用宏基因组技术确定组成絮团的微生物是否携带能够抵抗致病菌的基因、抵抗机制及其活性表达条件也是一个重要的研究方向。
益生菌
在人类中，益生菌被定义为“添加到食物中，能够帮助重构原声肠道菌群的活体微生物”。而在水产养殖环境中，这一定义可以被扩大为：“一种活的微生物，其能够通过调节宿主本身的微生物群落或环境微生物群落而改善宿主健康状态，或者能够最适化宿主的营养物质利用和免疫响应，或者能够改善养殖环境的质量。”
宏基因组技术十分适合用于监测使用益生菌的水产养殖环境中微生物群落的变化，其可以同时检测宿主共生微生物以及养殖环境微生物群落，从而更好的理解养殖系统中微生物群落的动力学变化，鉴定对于养殖物种生长所必需的微生物群体。
海水、海洋沉积物和养殖物种肠道菌群通常被作为筛选水产养殖益生菌的来源，特别是用于筛选能够产生抑制致病菌或具有特定生物活性的益生菌，基于功能的宏基因组技术能够发现编码特定生物活性分子的功能基因，从而辅助益生菌筛选工作。